1.加裝保護柱

　　保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現在的色譜儀在流動相吸入口、進樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學污然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱的措施。保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護柱屬消耗品,經過一定次數的樣品分析(50～100次)后,出現柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應考慮更換保護柱。

　　2.過濾流動相和樣品

　　流動相通常由水或緩沖溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經過色譜柱的流動相均應過濾,但在實際操作上應視具體情況而有所區別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機溶劑的質量且沒有受到污染時,過濾并無更多實際意義。

　　當流動相中含有緩沖鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當緩沖溶液放置一段時間(視環境溫度不同而異,夏季一般不超過48 h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應重新過濾。

　　所配制的樣品試液在注入流路系統前均要經0.45μm(0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動相的容器和色譜系統中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。

　　3.凈化樣品

　　當樣品中含有對色譜柱有損害的化學成分,如產生性吸附的蛋白質、糖等有機分子和強吸附性物質,以及可能對柱填料產生破壞作用的基團離子。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多余雜質組分。

　　4.避免過高的柱壓

　　雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是

　　(1)柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。

　　(2)當流速較大時,應采取流速梯度的辦法使流速分步到位。

　　(3)使用手動進樣閥時,進樣閥的切換要盡可能的快。否則

　　超過20%的壓力沖擊會很快使柱報廢。當使用多柱聯用時,柱切換要避免在高壓下進行。

　　5.注意溫度和酸堿度

　　一般以硅膠為基質的色譜柱最高使用溫度不超過60℃，以低于40℃為宜，特別是在流動相pH接近使用限度時，更應降低使用溫度。溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而，使填料性質改變，柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。目前的鍵合硅膠色譜柱標示的pH適用范圍可達2～10,但在實際使用時應避免的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害:

　　(1)在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相;

　　(2)降低使用溫度;

　　(3)檢驗完畢后立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”清洗;

　　6.正確及時的沖洗

　　開始試驗前,應了解柱中當前是何種溶劑。對于新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動相使用。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環境是純甲醇,如分析用流動相為緩沖液2有機溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇,再進分析用流動相，以防止在柱內發生鹽的沉淀;試驗結束后,要及時用適當的溶劑沖洗系統并最終過渡到純甲醇沖洗,對于含有緩沖鹽的流動相，辦法是先用與分析用流動相組成相同但不含緩沖鹽的溶液進行沖洗，再逐步過渡到純甲醇沖洗。多數報道沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍,但最終要以基線是否平直、壓力是否穩定決定。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的低使用濃度為≥5%,使用時應給予注意。